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酶免疫分析(enzyme immunoassay,EIA) 是目前臨床應(yīng)用最多的一類(lèi)免疫分析技術(shù),可分為非均相(或異相)酶免疫測(cè)定和均相酶免疫測(cè)定兩種方法。
均相酶免疫分析法(homogeneous enzyme immunoassay,HEI) 均相酶免疫分析主要有酶擴(kuò)大免疫測(cè)定技術(shù)和克隆酶供體免疫測(cè)定兩種方法。
非均相酶免疫分析法(heterogeneous enzyme immunoassay) 常用的酶免疫分析法多為非均相法,又可分為液相酶免疫法和固相酶免疫法兩種,以后者常用,稱(chēng)為酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)。ELISA是臨床上常用的免疫分析方法,目前常用的酶免疫分析儀都是基于ELISA技術(shù),稱(chēng)為酶免疫分析儀。
酶免疫分析儀的類(lèi)型、工作原理及基本結(jié)構(gòu):
根據(jù)儀器結(jié)構(gòu)和自動(dòng)化程度, 針對(duì)固相支持物的不同(如微孔板、試管、小珠、磁微粒等)作為吸附免疫試劑的載體,因而設(shè)計(jì)成不同的酶免疫分析儀,其基本工作原理就是分光光度法,在光電比色計(jì)或分光光度計(jì)的基礎(chǔ)上根據(jù)ELISA技術(shù)的特點(diǎn)而設(shè)計(jì)。包括:
微孔板固相酶免疫測(cè)定儀器 國(guó)際上微孔板式ELISA使用的載體為96孔板,采用直接對(duì)微板孔測(cè)定吸光度(A)的比色計(jì)。
1、酶標(biāo)儀
酶標(biāo)儀也稱(chēng)為ELISA測(cè)讀儀(ELISA reader),有單通道和多通道兩種類(lèi)型。自動(dòng)型多通道酶標(biāo)儀有多個(gè)光束和多個(gè)光電檢測(cè)器,檢測(cè)速度快。如8通道的儀器,設(shè)有8條光束(或8個(gè)光源)、8個(gè)檢測(cè)器和8個(gè)放大器。多通道酶標(biāo)儀的檢測(cè)速度較快。
酶標(biāo)儀的工作原理與主要結(jié)構(gòu)和光電比色計(jì)幾乎全相同(見(jiàn)圖16-1)。既可以使用和分光光度計(jì)相同的單色器,也可以使用干涉濾光片來(lái)獲單色光,此時(shí)將濾光片置于微孔板的前、后的效果是一樣的。
酶標(biāo)儀工作原理
酶標(biāo)儀的工作原理和光路與普通光電比色計(jì)的不同之處在于(見(jiàn)圖16-2) :比色液的容器不是比色皿,而是用塑料微孔板;酶標(biāo)儀以垂直光束通過(guò)微孔板中的待測(cè)液;酶標(biāo)儀通常使用光密度OD來(lái)表示吸光度?,F(xiàn)在大部分的酶標(biāo)儀還加上了判讀系統(tǒng)和軟件操作分析系統(tǒng)等。
酶標(biāo)儀光路系統(tǒng)簡(jiǎn)圖
2、半自動(dòng)微孔板式ELISA分析儀
半自動(dòng)微孔板式ELISA分析儀在酶標(biāo)儀的基礎(chǔ)上再配置加液器、溫育器、洗板機(jī)和測(cè)讀儀等分別組成。測(cè)定中需由手工將微孔板移至下一步驟的儀器中進(jìn)行。洗板機(jī)要求洗滌后固相表面非特異性物質(zhì)洗滌干凈,吸液后每孔中殘留的液量極小。較精密的洗板機(jī)有可調(diào)節(jié)的定時(shí)、洗滌液定量及振蕩微孔板的功能。
3、全自動(dòng)微孔板式ELISA分析儀
自動(dòng)化酶免疫分析系統(tǒng)由加樣系統(tǒng)、溫育系統(tǒng)、洗板系統(tǒng)、判讀系統(tǒng)、機(jī)械臂系統(tǒng)、液路動(dòng)力系統(tǒng)、軟件控制系統(tǒng)等組成,這些系統(tǒng)既獨(dú)立又緊密聯(lián)系。全自動(dòng)微孔板式ELISA分析儀用在大批量標(biāo)本的檢測(cè)中,不但提高了工作效率,而且測(cè)定的精密度亦得到改善。微孔板式ELISA儀器均為開(kāi)放式的,即適用于所有微板式ELISA試劑。ELISA檢測(cè)結(jié)果的精密度主要取決于試劑的質(zhì)量。全自動(dòng)ELISA儀器本身的精密度一般在3%左右。應(yīng)用優(yōu)質(zhì)試劑測(cè)定結(jié)果的精密度,定量測(cè)定可達(dá)到7%以下;常用的定性測(cè)定為感染性疾病抗原、抗體的檢測(cè),精密度在10%左右。
4、管式固相酶免疫測(cè)定儀
應(yīng)用管式固相載體的ELISA分析儀器不多,在我國(guó)應(yīng)用的有:
① 1990年德國(guó)推出的全自動(dòng)管式ELISA分析系統(tǒng)和配套試劑。試劑包括用鏈霉親和素包被的聚苯乙烯管、生物素結(jié)合的抗原或抗體,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體和顯色底物ABTS。測(cè)定中標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)可使用2星期,每次測(cè)定只需一點(diǎn)定標(biāo)。測(cè)定的精密度CV在3%左右。測(cè)定項(xiàng)目齊全,包括激素、腫瘤標(biāo)志、心肌標(biāo)志和感染性疾病的抗原、抗體等。② 法國(guó)生產(chǎn)的是一種特殊形狀的管式全自動(dòng)ELISA的分析儀,配套使用一個(gè)特別的“試劑條"(reagent strip)。
5、微粒固相酶免疫測(cè)定儀
美國(guó)生產(chǎn)自動(dòng)酶免疫分析儀應(yīng)用聚苯乙烯微粒(顆粒直徑0.47μm)作為固相,特異抗體或抗原包被在微粒上。第一次抗原抗體反應(yīng)后,將反應(yīng)液通過(guò)特制的玻璃纖維膜,聚苯乙烯微粒吸附在玻璃纖維膜上,液體則通過(guò)膜濾出。以后的反應(yīng)在膜上進(jìn)行,用過(guò)濾方式洗滌。標(biāo)記酶為堿性磷酸酶,底物為4-甲基傘酮磷酸酶,反應(yīng)后進(jìn)行熒光測(cè)定。其后生產(chǎn)的作藥物測(cè)定的熒光偏振分析儀與一體多項(xiàng)目全自動(dòng)免疫分析儀也在檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用。
6、磁微粒固相酶免疫測(cè)定儀
磁微粒可用磁鐵吸引與液相分離,是免疫測(cè)定中較為理想的固相載體,較早應(yīng)用磁微粒作為酶免疫測(cè)定固相的是瑞士出品的分析系統(tǒng),由分光光度測(cè)讀儀、磁鐵板和試劑3部分組成。試劑包括抗異硫氰酸熒光素(FITC)抗體,特異抗體或抗原包被的磁微粒(顆粒直徑1μm),F(xiàn)ITC結(jié)合的特異抗體或抗原,堿性磷酸酶標(biāo)記的特異抗體或抗原及底物酚肽(phenolphthalein)磷酸酯。其應(yīng)用的抗FITC-抗體是與親和素-生物素原理相同的間接包被系統(tǒng),反應(yīng)模式與電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定亦相似。反應(yīng)在試管中進(jìn)行,基本上用手工操作。反應(yīng)結(jié)束后將試管架放在磁鐵板上,磁微粒被磁鐵吸引至管底,完成固相與液相的分離。酶作用后反應(yīng)液呈粉紅色。