商品屬性：

是 phi29 的改造體，并經多次純化分離而得。在保留了 phi29 DNA 聚合酶的鏈置換、連續(xù)合成特性（>70kb）的基礎上，提高了滾環(huán)擴增的反應溫度，該酶酶可以在 42 度條件下持續(xù)的進行 DNA 合成（而 phi29 DNA 聚合酶在此溫度下反應活性很低）。

這種高溫的反應特性，在以下幾個方面對實驗有明顯的提升：

（1）在 NGS 測序中，其提升了高 GC 含量、回文結構等復雜模板的延伸能力，使得 NGS 的覆蓋度更均一，降低測序所需深度；

（2）高溫的反應條件，提升了基因組 DNA的 WGA 產物的合成量，并可以進行變溫擴增；

（3）降低測序中 Gap 區(qū)域，提升單細胞測序的數(shù)據(jù)質量和完整度；

（4）降低非特異性擴增產物；

（5）提升 MDA/RCA 等實驗的擴增性能和特異性。
除此外，該酶仍然具有很強的 3’→5’外切酶校讀功能，合成的 DNA 片段保真性高。該酶的外切酶活性較強，因此合成過程中引物需要 3’端硫代修飾，以降低外切活性對引物的切割效應。

儲存：-20℃可保存 3 年。
注意：在不同的實驗類型中，Oligo根據(jù)實驗需要自行選擇。
2. 引物和模板退火：體系配制完畢后，放置到 PCR 儀中，95℃ 3min，25℃ 3min。3. 退火完畢后，向退火產物中加入 1μl Equi-phi29 DNAPolymerase，混合均勻。
4. 擴增反應
4.1 恒溫擴增
對于環(huán)狀DNA模板采用恒溫反應作為推薦使用30℃恒溫擴增，30℃孵育 6~16h.該酶在 30-42℃條件下均可工作，
必要時根據(jù)實驗類型進行調整。
4.2 變溫擴增
對于基因組 DNA 或 cDNA 模板，推薦使用變溫擴增反應，以在短時間內獲得更高產量，并提高了低濃度模板的擴增產量。在 PCR 儀上做如下設置：
【30℃ 5min；42℃ 15s】循環(huán) 72 次（約 6h）或 120次（約 10h）.必要時，反應結束后，可于 65°C 10min 進行失活反應。
使用注意事項
（1）必要時可單獨額外添加終濃度 1 mM DTT 和 0.2mg/ml BSA，可提高反應效率。
（2）該酶的最佳反應溫度為 42 ℃ （在 30~42℃之間均有活性）。
（3）65℃ 10min 即可使該酶失活。
（4）根據(jù)實驗類型需要，調整dNTP的濃度100~500 μM。
（5）添加 Yeast Pyrophosphatase可提高 DNA 產量。
（6）反應引物 3’端的硫代修飾可避免引物降解。

PCR基本步驟及注意事項？

一、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法，它類似于生物體內DNA的復制。在生物體內DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而體外PCR反應同樣需要類似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列，實現(xiàn)對特定位置的擴增；PCR Buffer提供一個反應的緩沖環(huán)境；反應過程同生物體內一樣，DNA雙鏈打開，引物結合模板，延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過控制反應溫度實現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈，在退火溫度處引物結合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反復重復此過程即可實現(xiàn)對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環(huán)開始才產生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子，進一步循環(huán)地產生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。

在擴增后期,由于產物積累,使原來呈指數(shù)擴增的反應變成平坦的曲線,產物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續(xù)大量擴增，達到較高水平。因此，應適當調節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺期前結束反應， 減少非特異性產物。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA、質粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產物，cDNA等，但不能為RNA。對于不同類型的模板，其主要不同在于預變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠，質粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產物預變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板，只不過在第一輪循環(huán)時只有一個引物結合，合成另一條鏈。從第二輪開始，兩個引物均與特異位點結合，從而實現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增，原因就在于實現(xiàn)PCR反應的是DNA聚合酶，只能特意識別DNA鏈。

2.對于模版的量來說，一般25ul體系DNA的質量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結構比較復雜，提取的濃度也往往比較大，為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響，故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質粒及PCR產物由于其結構簡單，且提取濃度一般較低，則無需稀釋。

PCR實驗中應該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結果遇到沒有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準);

2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解?？赏ㄟ^PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應考慮樣本準備中雜質的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準確。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實驗設計和目的進行。

1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優(yōu)化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產物太長。PCR產物設計超過500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。

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